Produzione e caratterizzazione biochimica della laccasi NRC 620 del fungo ostrica e valutazione della sua efficacia nella chiarificazione del succo di mela.

Dopo 25 giorni di incubazione statica a 28°C, la laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC620 ha mostrato la massima attività nel terreno di coltura fungino. I valori ottimali di pH e temperatura per questo enzima erano rispettivamente 3,0 e 70°C. Dopo 2 ore di incubazione a 40°C e 50°C, l'attività enzimatica si è mantenuta rispettivamente al 68,33% e al 59,61%. Dopo 2 ore di incubazione in tampone citrato-fosfato (pH 7,0), l'attività enzimatica è rimasta al 100%. L'aggiunta di 10 mM di MgSO₄ e CuSO₄ ha aumentato l'attività enzimatica rispettivamente di circa il 21% e il 35%, mentre NaCl, MnCl₂, KCl e CaCl₂ hanno inibito l'attività enzimatica. Utilizzando ABTS come substrato, i parametri cinetici (Km e Vmax) della laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620 sono risultati rispettivamente pari a 1,99 mM e 16.217 μmol min−1 L−1. Il trattamento enzimatico dei campioni di succo di mela ha ridotto significativamente sia il pH che la viscosità, e tale riduzione è risultata correlata a un aumento del tempo di conservazione. Il trattamento con laccasi ha determinato una leggera diminuzione del contenuto fenolico totale del succo di mela, ma non è stata osservata alcuna riduzione dell'attività antiossidante.
Negli ultimi anni, i ricercatori si sono concentrati sull'applicazione delle biotecnologie verdi nell'industria alimentare. La laccasi è uno degli enzimi più utili nell'industria alimentare, trovando applicazione in settori quali la lavorazione dei succhi di frutta, la panificazione, la stabilizzazione del vino e il miglioramento delle qualità organolettiche dei prodotti alimentari.¹Molte piante superiori e microrganismi secernono laccasi,²Anche funghi come deuteromiceti, ascomiceti e basidiomiceti possono produrre laccasi.³La laccasi (EC 1.10.3.2) è un'ossidasi blu che riduce l'ossigeno molecolare ad acqua utilizzando un sistema costituito da tre diversi atomi di rame, ossidando così vari composti fenolici e ammine aromatiche. Durante la produzione di succhi di frutta e verdura, l'imbrunimento enzimatico e non enzimatico rappresenta un problema critico.⁴Poiché queste sostanze influiscono negativamente sul colore, sul sapore e sull'aroma del succo, devono essere rimosse.⁵
Tra tutti i frutti, le mele sono le più consumate al mondo e nell'Unione Europea. Nel 2019, la produzione di mele si è classificata al terzo posto a livello globale, superando gli 87 milioni di tonnellate.⁶Le mele contengono numerosi composti fenolici, tra cui flavonoidi e acidi fenolici come l'acido caffeico e l'acido clorogenico.⁷Poiché il succo di mela viene in genere consumato nella sua forma limpida, circa il 50-90% dei componenti fenolici viene perso durante il processo di filtrazione.⁸Oggi i consumatori tendono a scegliere prodotti minimamente trasformati, come il succo di mela torbido ad alto contenuto di polifenoli. Tuttavia, proprio a causa dell'elevato contenuto fenolico, questo tipo di succo di mela è particolarmente soggetto a scolorimento e imbrunimento.⁹Per ridurre o prevenire l'imbrunimento del succo di mela si utilizzano diverse tecnologie, tra cui metodi di trattamento termico come la pastorizzazione a 60-90 °C.¹⁰Tuttavia, secondo una ricerca di Sauceda-Gálvez¹¹Il trattamento termico può distruggere le sostanze chimiche volatili e influenzare le qualità organolettiche del succo di mela. Le alternative ai metodi di trattamento termico includono l'anidride carbonica supercritica, le radiazioni ultraviolette, gli ultrasuoni, l'alta pressione idrostatica o l'omogeneizzazione ad alta pressione.¹²L'efficacia di queste tecnologie e la resa di succhi di frutta idonei dipendono dai parametri utilizzati e dalle caratteristiche del prodotto. La loro diffusione è limitata dagli alti costi, dagli effetti negativi sulla qualità di alcuni prodotti alimentari o dall'inattivazione enzimatica inadeguata.^13,14
La laccasi può essere utilizzata per stabilizzare e chiarificare i succhi di frutta.¹⁵Gökmen et al.¹⁶Si raccomanda l'uso della laccasi per la chiarificazione dei succhi di frutta perché rimuove efficacemente i composti fenolici convertendoli in polimeri o oligomeri che vengono facilmente rimossi da qualsiasi membrana di ultrafiltrazione, consentendo al succo di mela di mantenere colore e limpidezza stabili fino a sei settimane a 50 °C. La laccasi purificata di *Trichoderma* è stata immobilizzata su microsfere di allumina e utilizzata per rimuovere selettivamente i composti responsabili del sapore sgradevole causato dalla contaminazione microbica del succo di mela.¹⁷
Circa l'80-90% dei componenti volatili del succo di mela sono esteri e aldeidi, che conferiscono al succo un aroma unico.¹⁸La laccasi proveniente da *Trametes versicolor* è stata immobilizzata su un supporto economico realizzato con fibre naturali ricavate da giovani gusci di cocco per la chiarificazione del succo di mela.¹⁹Precedenti studi hanno esaminato la stabilizzazione del succo di mela (colore e torbidità) utilizzando metodi senza enzimi o di immobilizzazione, oppure in combinazione con l'ultrafiltrazione.^5,19Tuttavia, l'effetto delle laccasi fungine sulle proprietà fisico-chimiche del succo di mela durante la conservazione rimane poco chiaro. Pertanto, lo scopo di questo studio è stato quello di indagare sperimentalmente le modifiche delle proprietà fisico-chimiche, del contenuto di composti fenolici e dell'attività antiossidante del succo di mela dopo il trattamento con laccasi fungine e due settimane di conservazione in frigorifero. Le laccasi hanno la capacità di ossidare i composti fenolici, il che le rende promettenti per l'uso in vari processi industriali, tra cui la chiarificazione del succo. Questo studio ha esaminato le laccasi provenienti da *Pleurotus ostreatus* NRC 620, concentrandosi sulle condizioni ideali per la loro attività ed efficacia nella chiarificazione del succo. Mentre la ricerca sui funghi ostrica (P. ostreatus NRC 620) è ancora limitata, studi precedenti hanno esaminato enzimi provenienti da diverse fonti fungine, come Trametes versicolor e Ganoderma lucidum. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare la potenziale applicazione di questo enzima nell'industria alimentare e di evidenziarne le proprietà uniche, in particolare il pH e la temperatura ideali.
L'acido 2,2′-azoossibis(3-etilbenzotiazolina-6-solfonico) (ABTS) è stato acquistato da Sigma-Aldrich (Canada). Tutti gli altri reagenti erano di grado analitico.
Il Centro Nazionale di Ricerca per la Raccolta di Colture Microbiche ha ottenuto il noto ceppo di fungo ostrica NRC620. Dopo la subcoltura, questo ceppo è stato conservato su terreni di coltura inclinati di agar patata destrosio a 4°C. Il metodo di preparazione dell'inoculo è stato il seguente: il micelio completamente sviluppato di 10 giorni è stato inoculato su piastre di agar patata destrosio e incubato a 28°C. Dopo 10 giorni, tre blocchi di micelio di 12 mm di diametro sono stati rimossi dal terreno di coltura agarizzato utilizzando un punzone metallico sterile e posti in beute Erlenmeyer da 250 mL con tappi di cotone contenenti 50 mL di terreno di coltura sterilizzato (pH 5,0, come descritto in precedenza da Othman et al.²⁰Le colture sono state incubate a 28 °C per 18 giorni. Successivamente, le colture sono state filtrate attraverso carta da filtro Whatman n. 1 e il surnatante risultante è servito come fonte enzimatica.
L'attività della laccasi è stata determinata utilizzando ABTS come substrato. La miscela di reazione (2 mL) conteneva 500 μL di ABTS 0,3 mM (disciolto in tampone di citrato di sodio 0,1 M, pH 4,5) e la quantità necessaria di campione enzimatico diluito con acqua distillata.^21,22Considerando che la laccasi può ossidare l'ABTS a temperatura ambiente (28 °C ± 2), l'ossidazione dell'ABTS è stata determinata misurando l'aumento dell'assorbanza a 420 nm (ε₄₂₀= 36.000 cm^-1 M ^-1) utilizzando uno spettrofotometro UV Agilent Carry-100. Era necessaria un'unità di attività laccasica per ossidare 1 μmol di ABTS al minuto. La concentrazione proteica è stata determinata con il metodo Bradford utilizzando albumina di siero bovino come controllo interno.^23,24
Dopo aver ottenuto l'enzima dal ceppo di fungo ostrica NRC 620, la sua attività è stata misurata a diversi intervalli di coltivazione per 25 giorni in condizioni statiche a 28 °C.
Per studiare l'effetto della temperatura sull'attività della laccasi, sono stati condotti esperimenti nell'intervallo di temperatura compreso tra 20 e 90 °C. Prima di aggiungere l'enzima e avviare la reazione, il tampone (0,1 M citrato di sodio, pH 4,5) e il substrato (ABTS) sono stati miscelati e incubati per 5 minuti a diverse temperature. La stabilità termica dell'enzima è stata valutata mediante incubazione in tampone fosfato di sodio 0,05 M (pH 7,0) a 40, 50, 60 e 70 °C per 2 ore, rispettivamente. L'attività residua è stata quindi valutata utilizzando il substrato ABTS.
L'effetto del pH sull'attività della laccasi è stato valutato utilizzando ABTS come substrato in tamponi citrato-fosfato 0,1 M con un intervallo di pH da 2,5 a 7,0. La soluzione enzimatica è stata incubata a 40 °C per due ore in tamponi citrato e Tris 0,1 M (pH 3, 4, 6 e 7) per valutare la stabilità del pH. L'attività residua con ABTS come substrato è stata calcolata dopo l'incubazione.
La laccasi è stata incubata per 10 minuti in tampone di fosfato di sodio (0,05 M, pH 7,0) contenente vari ioni metallici (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ e Mn2+) a concentrazioni rispettivamente di 2,5 mM e 10 mM. Il substrato (ABTS) è stato quindi aggiunto per avviare la reazione e l'attività relativa è stata valutata.
L'ossidazione dell'ABTS da parte della laccasi a varie concentrazioni (0,025–3 mM) è stata misurata a pH 4,5 per determinare i parametri cinetici (Vmax e Km). La cinetica^costantiI valori dell'equazione di Michaelis-Menten sono stati calcolati utilizzando un grafico di Lineweaver-Burk, che rappresenta il reciproco della velocità di reazione in funzione della concentrazione del substrato. Le costanti cinetiche sono state calcolate dal grafico di Lineweaver-Burk utilizzando il software GraphPad Prism versione 6.01.
Dopo aver lavato accuratamente le mele con acqua di rubinetto, queste sono state tagliate a metà e spremute utilizzando uno spremiagrumi automatico Braun MP80 (prodotto in Germania). Il succo è stato filtrato attraverso quattro strati di garza. Al gruppo di controllo non sono stati aggiunti enzimi, mentre al succo di mela appena preparato è stata aggiunta laccasi al 2,0% (la concentrazione più efficace testata), e il succo è stato poi conservato a 4 °C per due settimane.
L'acidità titolabile (TA) e il pH sono stati determinati secondo il metodo di Boulton et^al.27Il pH di ciascun campione è stato misurato utilizzando un pHmetro digitale (pHmetro JENWAY 3510). L'acidità titolabile (TA) è stata calcolata in base all'acido malico utilizzando la seguente formula.
Dove V e C rappresentano rispettivamente il volume (mL) e la concentrazione (0,1 mol/L) della soluzione di idrossido di sodio utilizzata nella titolazione. K è il coefficiente di conversione dell'acido malico, pari a 0,067, e W è la massa (g) del succo di mela.
I solidi solubili totali (^TDSIl contenuto di tutti i campioni di succo è stato determinato utilizzando un rifrattometro tascabile PAL-1 (ATAGO, Tokyo, Giappone). Dopo ogni misurazione, la lente ottica è stata risciacquata con acqua deionizzata e ogni campione di succo di mela è stato analizzato tre volte. Il valore per ciascun campione è stato calcolato facendo la media delle tre misurazioni. La media ± deviazione standard per ciascun campione di succo di mela è stata calcolata facendo la media di questi risultati.
La viscoelasticità dei campioni di succo di mela è stata valutata utilizzando un viscosimetro rotazionale (RV, Rheotest 2, Germania). Il campione è stato posizionato all'interno del cilindro "S2" del viscosimetro. La viscosità apparente è stata rappresentata dalla pendenza della curva sforzo di taglio-velocità di taglio, calcolata a partire dallo sforzo di taglio e dalle corrispondenti curve a diverse velocità di taglio (da 1,00 a 437,4 s⁻¹). La formula per il calcolo della viscosità apparente è la seguente:
Dove η è la viscosità apparente (cP), τ è lo sforzo di taglio (dyn/cm²), γ è la velocità di taglio (sec⁻¹) e (τ) è calcolato utilizzando i valori di coppia (α) e cilindro (Z) mediante la seguente formula: τ = Z . α.
L'indice di imbrunimento è stato determinato secondo il metodo di Meidav ​​​​et^al.29Un campione di succo da 10 ml è stato centrifugato a 2750 xg per 10 minuti. 5 ml del surnatante del succo sono stati miscelati con 5 ml di etanolo al 95%. L'assorbanza della miscela è stata misurata a 420 nm utilizzando uno spettrofotometro UV Shimadzu (UV-1601 PC).
Il contenuto totale di fenoli (TPC) è stato determinato colorimetricamente utilizzando il reagente di Folin-Ciocalteu come descritto da Boulton et al.^[27]. È stata costruita una curva standard dell'acido gallico per concentrazioni da 0 a 500 mg/L (^r²= 0,997). I risultati sono espressi in equivalenti di acido gallico (mg GAE/mL).
Aggiungere 125 μL di acqua distillata e 2850 μL di soluzione FRAP a 25 μL di succo di mela e lasciare la miscela al buio per³⁰min. Quindi misurare l'assorbanza a 593 nm utilizzando uno spettrofotometro UV Shimadzu (UV-1601 PC). Il reagente FRAP è stato preparato miscelando 300 mM tampone acetato (pH 3,6), 20 mM cloruro di ferro(III) e 10 mM 2,4,6-tris(2-piridil)triazina (TPTZ) (disciolto in 40 mM HCl) in un rapporto di 10:1:1. È stata generata una curva standard utilizzando Trolox come standard (^R²= 0,999) e i risultati sono espressi in μM Trolox/mL.
L'attività antiossidante dei succhi trattati e non trattati è stata determinata utilizzando il metodo DPPH per valutare la loro capacità di neutralizzare i radicali liberi DPPH.³¹Dieci microlitri di succo sono stati miscelati con 1 ml di una soluzione di DPPH (100 μM) in metanolo. Dopo la reazione al buio per 30 min, l'assorbanza della miscela è stata misurata a 517 nm utilizzando uno spettrofotometro UV Shimadzu (UV-1601 PC). I risultati sono stati espressi come equivalenti di trolox (μM trolox/ml) sulla base di una curva di calibrazione (_^R2= 0,990).
I dati ottenuti hanno mostrato che la massima produzione di laccasi è stata osservata nei funghi ostrica NRC 620 al termine del 18° giorno di fermentazione, raggiungendo un'attività di 1302 U/L. Questo dato è servito come base per determinare il tempo di coltivazione ottimale per la produzione di laccasi (Figura 1). Sebbene la produzione enzimatica aumentasse con l'aumentare del tempo di coltivazione, il tasso di incremento non era direttamente proporzionale al tempo di coltivazione; dopo 21 giorni, l'attività enzimatica era aumentata di soli 90 U/L (fino a 1390 U/L). Pertanto, 18 giorni sono stati infine selezionati come tempo di coltivazione ottimale per bilanciare la resa del prodotto con i benefici economici derivanti da un tempo di coltivazione più lungo.
Effetto del tempo di coltivazione sulla resa di laccasi in Pleurotus ostreatus NRC 620. Tre blocchi di micelio fungino (12 mm) sono stati inoculati in 50 ml di terreno sterile e quindi coltivati ​​a 28 °C per tempi diversi.
In linea con altri studi, i nostri risultati indicano che il periodo di coltura ideale per raggiungere il picco di secrezione di laccasi da parte dei funghi è probabilmente compreso tra 7 e 36 giorni.³²Secondo Ezike et al.³³, *Trametes polyzona* WRF03 ha prodotto la quantità più elevata di laccasi alla fine del nono giorno di fermentazione, con un'attività specifica di 1637 U/mg di proteina. Inoltre, Othman et al.³⁴Abbiamo scoperto che *Trichoderma harzianum* S7113 secerneva una grande quantità di laccasi al quinto giorno di coltura. Il tasso di produzione di laccasi raggiungeva un picco di attività al quattordicesimo giorno e poi diminuiva gradualmente.³⁴Sebbene la secrezione enzimatica possa verificarsi anche durante la fase di crescita principale, di solito raggiunge il picco durante la fase intermedia ed è innescata dal consumo di una fonte di carbonio o di azoto.^34,35
Sebbene la laccasi di Pleurotus ostreatus NRC 620 abbia mostrato un'elevata attività in un ampio intervallo di temperature, da 50 °C a 80 °C, avvicinandosi al picco di attività (69-98%), la sua attività massima è stata osservata a 70 °C (Fig. 2a). Al di fuori di questo intervallo di temperature, l'attività enzimatica è diminuita a circa 70 °C. Questi risultati suggeriscono che l'enzima è attivo ad alte temperature, probabilmente perché l'alta temperatura aumenta l'energia cinetica della reazione.
Effetto della temperatura di reazione (a) e del pH (b) sull'attività della laccasi in *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperature comprese tra 20 e 90 °C sono state raggiunte pre-incubando la miscela a diverse temperature per 5 minuti prima di aggiungere l'enzima e avviare la reazione. L'effetto del pH sull'attività della laccasi è stato valutato utilizzando ABTS come substrato in soluzioni contenenti tampone citrato-fosfato 0,1 M in un intervallo di pH da 2,5 a 7,0.
Secondo Ezike et^al.33, la temperatura ottimale per la laccasi WRF03 di *Trametes polyzona* è di 55 °C, che è la stessa di quella per *Ganoderma lucidum*^laccasi36e simile alla temperatura ottimale (50 °C) per *Trametes polyzona* KU-RNW02737^laccasi . ^Baldrian38Si noti che, come per altri sistemi enzimatici che degradano la lignina, l'intervallo di temperatura ideale per la laccasi è compreso tra 50 e 70 °C.
I risultati hanno mostrato che l'enzima ha mostrato la massima attività a pH 3,0, raggiungendo il 94% di attività a pH 3,5. Tuttavia, è rimasto attivo in un ampio intervallo di pH da 2,5 a 7,0 (Figura 2b). Inoltre, ha mostrato una maggiore attività in condizioni acide rispetto a condizioni neutre o alcaline. La sua attività è rimasta almeno del 77% nell'intervallo di pH da 2,5 a 4,5, ma ha raggiunto solo circa il 38% a pH 7,0. Il pH ottimale per la laccasi di *Trametes polyzona* WRF03 era 4,533, che è lo stesso del pH per le laccasi di *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 e *Trametes hirsuta* 41. Tuttavia, secondo lo studio di Chairin et al.⁴², il pH ottimale per la laccasi di *Polymorpha f. sp.* WR710-1 è 2,2, mentre il pH ottimale per la laccasi di *Polymorpha f. sp.* IBL-04 è 5,043. Il legame degli anioni idrossido (inibitore della laccasi) agli atomi di rame della laccasi T2/T3 potrebbe essere la ragione della diminuzione dell'attività della laccasi in condizioni di pH neutro o alcalino. Ciò potrebbe interrompere il trasferimento interno di elettroni dal centro T1 al centro T2/T3, quindi^limitandol'attività enzimatica23,44
Incubando l'enzima a diverse temperature, si è scoperto che sia il tempo di incubazione che la temperatura influenzavano la stabilità dell'enzima. In particolare, la laccasi di *Trametes polyzona* NRC 620 ha mostrato una maggiore stabilità a 40℃ e 50℃, mantenendo rispettivamente il 68,33% e il 59,61% della sua attività iniziale dopo 120 minuti (Figura 3a). Al contrario, nelle stesse condizioni (40℃ e 50℃, 120 minuti), la laccasi di *Trametes polyzona* WRF03 ha mantenuto rispettivamente il 64,38% e il 42,92% della sua attività.³³Al contrario, l'aumento del tempo e della temperatura di incubazione ha ridotto la stabilità della laccasi di *Trametes polyzona* NRC 620; dopo l'incubazione a 60℃ e 70℃ per 60 minuti, la sua attività è diminuita rispettivamente al 39,24% e all'1,72% (Figura 3a). In linea con i risultati sperimentali, la laccasi di *Trametes polyzona* WRF03 ha mostrato una maggiore stabilità a 40 e 50℃ durante l'intero processo di trattamento termico.³³Allo stesso modo, Lueangjaroenkit et^al.37e presidente et^al.42È stata riportata la stabilità delle laccasi di Trametes polyzona KURNW027 e Trametes polyzona WR710-1 a 50 °C per 1 ora, rispettivamente. In quanto utile biocatalizzatore applicabile in vari campi biotecnologici, la laccasi dovrebbe possedere una buona stabilità e prestazioni in un ampio intervallo di temperature.
Stabilità termostatica (a) e stabilità del pH (b) della laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620. La stabilità termostatica è stata valutata incubando la soluzione enzimatica in tampone fosfato di sodio 0,05 M (pH 7,0) a 40, 50, 60 e 70 °C per 2 ore, rispettivamente. La stabilità del pH è stata valutata incubando la soluzione enzimatica in tampone citrato 0,1 M e tampone Tris (pH 3, 4, 6 e 7) a 40 °C per 2 ore. L'attività residua è stata calcolata utilizzando ABTS come substrato dopo l'incubazione.
Per determinare le condizioni ottimali per l'uso e la conservazione dell'enzima, abbiamo studiato l'effetto del pH sulla stabilità della laccasi. L'esposizione a diversi valori di pH ha influenzato significativamente la stabilità della struttura proteica, influenzando di conseguenza la stabilità e l'attività della molecola enzimatica. I risultati hanno mostrato che l'enzima era meno stabile in condizioni acide, mentre presentava una maggiore stabilità a valori di pH più elevati (aree neutre e alcaline). A valori di pH di 7,0, 6,0, 4,0 e 3,0, i tassi di ritenzione dell'enzima dopo 120 minuti erano rispettivamente di circa il 100%, il 62,54%, il 52,39% e l'11,14% (Fig. 3b). La laccasi di *Strombus multisus* WRF03 ha mostrato una maggiore stabilità a valori di pH neutri (5,5–6,5) e una minore stabilità a valori di pH acidi (inferiori a 4,0). Dopo 120 minuti a valori di pH pari a 5,5, 6,0 e 6,5, i tassi di ritenzione dell'enzima sono stati rispettivamente di circa l'82%, il 100% e il 93%.³³Khairin et al.⁴²hanno notato che la laccasi di Trametes polyzona WR710-1 era stabile nell'intervallo di pH da 6,0 a 7,0, mentre Sayed et al.⁴⁵hanno dimostrato che la laccasi è più stabile in condizioni di pH neutro. Tuttavia, la laccasi di Cerrena unicolor ha mostrato stabilità anche in condizioni alcaline (pH 9,0).⁴⁶Le laccasi studiate hanno mostrato un'elevata stabilità in un ampio intervallo di pH. Questa potrebbe essere una caratteristica importante per le applicazioni industriali.
Poiché alcuni ioni metallici hanno effetti sia stimolatori che inibitori sull'attività enzimatica, è necessario considerare i loro effetti su tale attività nelle applicazioni industriali. Ciò è fondamentale perché gli ioni metallici sono comuni contaminanti ambientali che possono influenzare la stabilità e la sintesi degli enzimi extracellulari.⁴⁷Per studiare gli effetti di più ioni metallici sulla laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620, abbiamo condotto esperimenti corrispondenti. Come mostrato nella Figura 4, a seconda del tipo di metallo utilizzato, l'aumento della concentrazione di ioni metallici da 2,5 mM a 10 mM ha influenzato negativamente la funzione enzimatica. Ad esempio,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺, E^Cu²⁺potrebbe stimolare e attivare l'attività enzimatica, mentre^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺, E^K⁺potrebbero inibire l'attività enzimatica. A una concentrazione di 10 mM, gli ioni Cu²⁺ e Mg²⁺ sono risultati i più potenti attivatori dell'attività della laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620, fornendo un grado di attivazione rispettivamente di circa il 34% e il 20%. Tuttavia, a una concentrazione di 10 mM, gli ioni Ca²⁺ sono risultati i più potenti inibitori della laccasi, riducendo l'attività enzimatica di circa il 60%.
Effetto degli ioni metallici sull'attività della laccasi di Pleurotus ostreatus NRC 620. La laccasi è stata incubata per 10 minuti in tampone fosfato di sodio (0,05 M, pH 7,0) contenente diversi ioni metallici a concentrazioni di 2,5 mM e 10 mM. La reazione è stata quindi avviata con l'aggiunta del substrato (ABTS), dopodiché è stata misurata l'attività relativa.
I nostri risultati sono coerenti con quelli di altri autori che hanno riscontrato che Mg²⁺ e Cu²⁺ aumentano l'attività di *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ hanno scoperto che la laccasi di *Xylaria* sp. è stimolata in una certa misura dagli ioni rame (Cu²⁺). Inoltre, Foroutanfar et al.⁴⁹ e Si et al.⁵⁰ hanno condotto studi simili sulle laccasi di *Paraconiothyrium variabile* e *Trametes pubescens*, rispettivamente. Il sito di legame del rame di tipo II (T2) di questo enzima può essere saturato con Cu²⁺ a una data concentrazione, il che potrebbe spiegare la stimolazione dell'attività della laccasi a concentrazioni più elevate di Cu²⁺³⁹. Poiché le laccasi dei funghi a marciume bianco sono ossidasi contenenti più atomi di rame, gli effetti degli ioni di rame sull'attività della laccasi sono diversi e vanno da stimolatori e inibitori a neutri.⁵¹ Al contrario, Zhou et al^{. [52]}ha riferito che^Cu²⁺ha inibito l'attività della laccasi della termite sotterranea di Taiwan (Odontotermes formosanus). Tuttavia, le laccasi di Cerena sp. HYB07^[53]e Clitocybe maxima^[54]non sono stati influenzati dagli ioni di rame.
La specificità del substrato è stata rappresentata dai suoi parametri cinetici (Km e Vmax); maggiore è l'affinità di legame del substrato all'enzima, minore è il valore di Km e maggiore è la specificità del substrato.^3,21,55I parametri cinetici (Km e Vmax) della laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620 sono stati determinati utilizzando il software GraphPad Prism 6.0 tramite la creazione del grafico di Lineweaver-Burk (Figura 5). Utilizzando ABTS come substrato, i risultati sono stati 1,99 mM e 16217 μmol^{min⁻¹ L⁻¹,}rispettivamente. Elsayed et al.²¹hanno riportato che i valori di Km per l'ossidazione dell'ABTS erano rispettivamente 0,1 mM e 0,064 mM, indicando un'elevata affinità degli isoenzimi Lac A e Lac B per l'ABTS. Inoltre, i valori di Vmax erano 0,182 μmol^min⁻¹e 0,603 μmol^min⁻¹, rispettivamente. Il valore Km ottenuto era inferiore a quello di Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); inoltre, anche il loro valore Vmax (1429 mmol min⁻¹) era^inferiorequando si utilizza ABTS come substrato.33 Allo stesso modo, i valori di Km delle concentrazioni di laccasi di Lentinus squarrosulus MR13 e Trametes sp. AH28-2 erano rispettivamente 0,0714 mM e 0,025 mM, e i valori di Vmax erano 0,0091 mM min−1 e 0,67 mM min−1 mg−1 (relativamente ad ABTS)^{, rispettivamente.56,57}
È stato studiato l'effetto della concentrazione di ABTS sull'attività della laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ed è stato tracciato un grafico di Lineweaver-Burk del reciproco della velocità di reazione iniziale in funzione della concentrazione di ABTS. La reazione di ossidazione dell'ABTS con diverse concentrazioni (0,025–3,0 mM) di laccasi è stata misurata a pH 4,5 per determinare i parametri cinetici (Vmax e Km). Le costanti cinetiche di Michaelis-Menten sono state calcolate utilizzando il grafico di Lineweaver-Burk del reciproco della velocità di reazione in funzione della concentrazione del substrato. Le costanti cinetiche sono state calcolate dal grafico di Lineweaver-Burk utilizzando il software GraphPad Prism 6.01.
Gli enzimi chiarificanti tradizionali, come le pectine, idrolizzano le sostanze pectiche, riducendo la viscosità e la torbidità. Essi scompongono efficacemente i polisaccaridi strutturali e sono spesso utilizzati in combinazione con altri enzimi, come cellulasi ed emicellulasi, per migliorare la resa e la limpidezza. Tuttavia, le pectine non agiscono specificamente sui composti fenolici, che sono i principali responsabili della torbidità e dell'imbrunimento ossidativo, in particolare nei succhi di frutta come quello di mela e d'uva.⁵⁸Al contrario, le laccasi catalizzano l'ossidazione dei composti fenolici, polimerizzandoli in molecole più grandi e insolubili che possono essere rimosse mediante sedimentazione o filtrazione. Questo meccanismo non solo migliora la limpidezza, ma prolunga anche la durata di conservazione del succo riducendo la probabilità di imbrunimento ossidativo causato dai composti fenolici. Inoltre, i processi di chiarificazione basati sulle laccasi possono essere effettuati in condizioni di lavorazione blande (pH 3,5–5,5, temperatura 25–40 °C), il che li rende adatti ai succhi delicati senza comprometterne le proprietà nutrizionali o organolettiche.⁵⁹Gli studi hanno dimostrato che il trattamento con pectinasi può chiarificare il succo in 1-2 ore, mentre il trattamento con laccasi richiede in genere un tempo di reazione più lungo (3-6 ore) per ridurre completamente i composti fenolici. Tuttavia, questo processo può essere ottimizzato immobilizzando l'enzima o combinando la laccasi con metodi di chiarificazione meccanica.⁶⁰In questo studio, la profilazione enzimatica dell'estratto grezzo ha rivelato significative attività di laccasi e α-amilasi, mentre le attività di pectinasi e xilanasi erano estremamente basse e non è stata rilevata alcuna attività di cellulasi. Pertanto, la riduzione della torbidità e del contenuto fenolico è stata principalmente dovuta all'azione della laccasi, mentre la variazione di viscosità potrebbe essere in parte dovuta all'azione dell'amilasi.
La Tabella 1 mostra i parametri fisico-chimici del succo di mela appena spremuto e dei campioni trattati con laccasi. I risultati hanno mostrato che la resa del succo di mela appena spremuto (71,59%) era inferiore a quella dei campioni trattati con laccasi (87,34%). Questi risultati sono coerenti con le scoperte di Pilnik e Orange.⁶¹, che hanno indicato che l'uso di enzimi nella lavorazione della frutta può aumentare la resa del succo, migliorare la filtrazione e ottenere un succo limpido e di alta qualità per la concentrazione. L'aumento della resa del succo è dovuto principalmente all'aumento del contenuto di zuccheri solubili nel succo. Durante l'idrolisi enzimatica della frutta, la mesoglea e la pectina presenti nelle pareti cellulari del prodotto vengono distrutte e convertite in sostanze solubili come zuccheri neutri e acidi^62.Il valore del pH del succo di mela trattato con enzimi era significativamente inferiore a quello del gruppo di controllo (P < 0,05) e il valore del pH di entrambi i gruppi è aumentato significativamente durante la conservazione (Tabella 1). Questi risultati sono coerenti con quelli di Mark et al.⁶³, che hanno notato che il pH del succo di anacardi diminuiva dopo la conservazione a seguito del trattamento termico. La degradazione della pectina e la formazione di acido galatturonico dopo il trattamento enzimatico potrebbero essere responsabili dell'aumento del pH durante la conservazione. Il pH dei campioni trattati con enzimi è rimasto tra 4,05 e 4,31 per tutta la durata della conservazione, mentre il pH del succo di mela non trattato variava tra 4,12 e 4,33.
L'acidità totale (TA) sia dei campioni non trattati che di quelli trattati con laccasi ha mostrato una tendenza decrescente con l'aumentare del tempo di conservazione (Tabella 1). La diminuzione dell'acidità è stata attribuita alla conversione degli acidi organici in carboidrati o a reazioni enzimatiche, nonché all'ossidazione durante la conservazione del succo.⁶⁴L'acidità totale del succo di mela di controllo e dei campioni trattati con enzimi era inferiore a quella degli altri succhi (succo di fragola 0,9%, succo di prugna 2,2%, succo di kumquat 1,0%, succo di albicocca 2,4%, succo d'arancia 0,8%), ma simile a quella di altri succhi (ad esempio, succo di pera 0,3%).⁶²Queste differenze nel succo di mela fresco non trattato possono essere dovute a vari fattori come le condizioni di coltivazione, fattori genetici, livello di maturazione e metodi di lavorazione.⁶⁵La diminuzione dell'acidità totale del succo di mela di controllo e di quello trattato con laccasi è coerente con i risultati presentati da Singh et al.⁶⁶riguardo alla diminuzione dell'acidità totale del succo di mela Jin Nuo dopo 74 giorni di conservazione. D'altra parte, Oshmiansky e Wojdylo⁶⁷Non sono state riscontrate variazioni significative nell'acidità del succo di mela durante lo studio dell'effetto dei metodi di chiarificazione tradizionali.
I risultati presentati nella Tabella 1 indicano che il valore dei solidi solubili totali (TSS) del succo di mela trattato con laccasi era superiore a quello del campione non trattato. Questi risultati sono coerenti con gli studi pubblicati.^{. 68}Inoltre, la Tabella 1 mostra che il valore TSS del gruppo di controllo del succo di mela era 9,58 al punto temporale iniziale e ha raggiunto 11,05 alla fine del periodo di conservazione. Questi valori sono inferiori ai valori TSS del succo di mela fresco riportati da Hamid et al.^{. 69}(11,2 e 11,80, rispettivamente). Il valore TSS dei campioni di succo di mela trattati con laccasi è aumentato significativamente, partendo da 11,23 e raggiungendo 12,93 dopo due settimane di conservazione a 4°C (Tabella 1). Un aumento simile del TSS durante la conservazione è stato osservato anche negli agrumi, nei limoni e nelle arance dolci. L'aumento dei solidi solubili totali (TSS) durante la conservazione può essere dovuto all'idrolisi dei polisaccaridi (amido) in monosaccaridi (zuccheri), all'aumento della concentrazione dovuto alla disidratazione del succo e alla degradazione della pectina nel succo in solidi solubili. L'aumento dei solidi solubili totali (TSS) è probabilmente dovuto all'aumento degli zuccheri solubili, che possono essere formati dalla conversione della pectina o della cellulosa in zuccheri solubili da parte della pectina o della cellulasi, rispettivamente, o dall'idrolisi dell'amido in zuccheri, come riportato da Hamed et al.^69.L'effetto della laccasi sulle proprietà del succo di mela può essere osservato visivamente, poiché il succo di mela trattato con laccasi presenta una migliore fluidità e una viscosità inferiore rispetto al succo non trattato. Questa osservazione è riportata nella Tabella 1; la viscosità del campione trattato con l'enzima era di 1,87 cP, mentre la viscosità del campione di controllo era di 2,95 cP. Questa significativa diminuzione della viscosità è probabilmente dovuta alla maggiore capacità di ritenzione idrica delle sostanze simili alla pectina e alla formazione di una struttura reticolare coesiva.
In questo studio, è stato studiato l'effetto della laccasi sull'indice di imbrunimento (BI) del succo di mela misurando l'assorbanza a 420 nm utilizzando uno spettrofotometro. I risultati sono riportati nella Tabella 1. Durante la conservazione, il BI dei campioni di succo di mela sia nel gruppo trattato che in quello non trattato ha mostrato una tendenza all'aumento graduale. Il BI riflette il grado di imbrunimento e può servire come^{un importante}indicatore delle reazioni di imbrunimento enzimatiche e non enzimatiche. L'assorbanza è aumentata significativamente durante la conservazione (P < 0,05). Al termine della conservazione, il_A420Il valore dei campioni di succo di mela nei gruppi di controllo e trattati con enzimi è aumentato rispettivamente di circa il 217% e il 121% (Tabella 1). I risultati indicano che il trattamento enzimatico può ridurre efficacemente il grado di imbrunimento di circa il 56%. I risultati di Bezerra et al.^[19] sono coerenti con i nostri risultati; hanno utilizzato laccasi-glutaraldeide-fibra di cocco per chiarificare il succo di mela, riducendone il colore originale del 61%.
Sebbene i polifenoli presenti nei succhi di frutta abbiano effetti nutrizionali e terapeutici positivi sul corpo umano, possono anche reagire con le proteine, causando intorbidimento, sedimentazione o opacità del succo, alterandone così il sapore e l'aroma e riducendone la durata di conservazione.⁷¹Lo scopo di questo studio era ridurre in modo sicuro il contenuto di composti fenolici del succo di mela utilizzando la laccasi di Pleurotus ostreatus NRC 620. I risultati presentati nella Tabella 1 mostrano che il contenuto totale di composti fenolici del succo di mela trattato con laccasi è stato significativamente ridotto prima della conservazione a 4 °C. Inoltre, il contenuto totale di composti fenolici è diminuito anche durante la conservazione in entrambi i campioni studiati (Tabella 1). Ricerca di Sandri et al.⁷²hanno dimostrato che il succo di mela trattato con enzimi può mantenere la sua attività antiossidante e il contenuto di composti fenolici. Tuttavia, i risultati di uno studio di Lettera et al.⁷³Gli studi dimostrano che il trattamento del succo d'arancia con laccasi fungina può ridurre il contenuto di composti fenolici fino al 45%.
È stato dimostrato che i composti fenolici possiedono proprietà quali la capacità di neutralizzare i radicali liberi, ridurre e spegnere l'ossigeno singoletto, trasferire atomi di idrogeno e donare elettroni ai radicali liberi, il che li rende potenti antiossidanti.⁷⁴Pertanto, in questo studio, sono stati utilizzati i metodi basati su DPPH e FRAP per valutare l'effetto della laccasi sull'attività antiossidante del succo di mela conservato in frigorifero per 14 giorni (Tabella 2). Entrambi i metodi hanno mostrato un aumento dell'attività antiossidante durante la conservazione, che potrebbe essere dovuto all'aumento dei composti fenolici liberi o alla formazione di prodotti della reazione di Maillard (MRP), con i prodotti della reazione di Maillard che probabilmente sono la causa dell'aumento dell'attività antiossidante.⁷⁵Le reazioni di imbrunimento non enzimatiche (tra cui la degradazione dell'acido ascorbico, le reazioni di Maillard e la degradazione degli zuccheri catalizzata da acidi) producono pigmenti marroni (melanoidine). I prodotti intermedi della degradazione dell'acido ascorbico e i prodotti della degradazione degli zuccheri (come i composti carbonilici) possono reagire con gli amminoacidi attraverso le reazioni di Maillard.⁷⁶Sebbene l'imbrunimento di frutta e verdura durante la conservazione sia stato ampiamente studiato, la nostra comprensione di queste reazioni rimane limitata.⁷⁷Rispetto al metodo FRAP, il succo di mela trattato con laccasi ha mostrato un'attività antiossidante significativamente inferiore con il metodo DPPH (Tabella 2), e l'attività antiossidante di tutti i campioni è aumentata significativamente con l'aumentare del tempo di conservazione. In questo studio sono stati utilizzati due metodi diversi per determinare l'attività antiossidante perché i loro principi differiscono. Il metodo DPPH misura la capacità di neutralizzare i radicali liberi, mentre il metodo FRAP misura la capacità di ridurre gli ioni di ferro. Pertanto, si raccomanda di utilizzare più metodi per determinare l'attività antiossidante al fine di comprendere meglio l'attività antiossidante dei campioni studiati.⁷⁸
Uno dei risultati chiave di questo studio è che la laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620 mostra un'attività ottimale a 70 °C e pH 3,0. Rispetto ad altre laccasi fungine comunemente utilizzate per la chiarificazione dei succhi, come le laccasi di *Trametes versicolor* e *Ganoderma lucidum*, la laccasi di *P. ostreatus* NRC 620 presenta una maggiore stabilità termica e un pH più acido. Le laccasi di *Trametes versicolor* e *Ganoderma lucidum* mostrano tipicamente un'attività ottimale nell'intervallo di 50-60 °C e a valori di pH compresi tra 3,5 e 5,0. Questa differenza può contribuire a migliorare l'efficienza della chiarificazione dei succhi, soprattutto per i succhi acidi dove la stabilità a valori di pH più bassi è fondamentale. La caratteristica unica di *P. Rispetto ad altre laccasi fungine studiate, la laccasi di *Pleurotus ostreatus* NRC 620 mostra la capacità di funzionare efficacemente in condizioni più difficili. La sua temperatura di attività ottimale più elevata suggerisce potenziali vantaggi nelle applicazioni industriali, come velocità di reazione più rapide e ridotta contaminazione microbica. Il suo basso pH, che si adatta bene alla natura acida di molti succhi, può essere utile nei processi di chiarificazione dei succhi. Questi risultati giustificano un'ulteriore esplorazione per l'applicazione su larga scala, rendendo *Pleurotus ostreatus* NRC 620 una valida alternativa alle tradizionali fonti di laccasi fungina. Rispetto agli studi precedenti, abbiamo scoperto che la temperatura ottimale è 60°C e il pH ottimale è 3,0. Dopo la reazione a 60°C per 80 minuti, la laccasi di *Ganoderma lucidum* ha mantenuto⁴⁶% della sua attività.79 Secondo Kurniawati e Nicelle⁸⁰Gli enzimi di *Ganoderma lucidum* mostrano una stabilità da eccellente a moderata a 25°C e valori di pH compresi tra 5,0 e 8,0, e stabilità a pH 6,0 e temperature comprese tra 10 e 30°C. In questo studio, abbiamo scoperto che il pH e la temperatura ottimali per l'attività enzimatica di *Pleurotus ostreatus* erano rispettivamente 3,0 e 70°C. Dopo l'incubazione a 40°C e 50°C per due ore, l'enzima ha mantenuto rispettivamente il 68,33% e il 59,61% della sua attività. Inoltre, la laccasi di Pleurotus ostreatus NRC 620 ha mostrato un'elevata attività in un ampio intervallo di temperature da 50°C a 80°C, raggiungendo quasi l'attività massima (69%-98%), con l'attività massima osservata a 70°C.
In conclusione, la laccasi del fungo ostrica NRC620, ottenuta in condizioni statiche, ha dimostrato attività e stabilità ottimali in un ampio intervallo di pH e temperatura, evidenziando una stabilità superiore rispetto ad altre fonti enzimatiche. L'aggiunta di 10 mM di MgSO₄ e CuSO₄ ha incrementato l'attività enzimatica rispettivamente di circa il 21% e il 35%. Quando incorporato nel succo di mela, l'enzima ha ridotto il pH e la viscosità, mentre il contenuto fenolico è diminuito solo leggermente durante la conservazione.
I risultati confermano il potenziale della laccasi nell'industria alimentare, in particolare nella chiarificazione delle bevande. Decomponendo in modo specifico i composti fenolici, la laccasi non solo riduce la torbidità e migliora la limpidezza, ma preserva anche la qualità dei succhi di frutta in condizioni operative blande. A differenza dei tradizionali agenti chiarificanti come gelatina, bentonite e gel di silice, la laccasi non genera rifiuti né altera gli aromi delle bevande, risultando quindi un'opzione più ecologica e sostenibile. Inoltre, rispetto ad altri enzimi e metodi di filtrazione, la laccasi offre una soluzione mirata ed economicamente vantaggiosa senza compromettere la qualità del prodotto.
Kyomuhimbo, HD e Brink, HG. Applicazioni e strategie di immobilizzazione delle laccasi contenenti rame; una revisione. Heliyon 9, e13156 (2023).